金年会香烟染毒系统 | 自动、灵活、安全建立香烟暴露小鼠模型——助力慢阻肺的病理研究

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和（或）肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。其致残率和病死率居高不下，全球40岁以上人群中的发病率已高达9%～10%，严重危害着人们的健康。

慢阻肺以持续气流受限为特征，这种气流受限呈进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。气流受限和气道阻塞作为该疾病最重要的病理生理改变，其确切病因尚不完全明了，但普遍认为是由个体易患因素和环境因素共同作用的结果。许多患者还常常伴随其他有临床症状的慢性病，这无疑增加了慢阻肺的发病率和病死率。

在探讨慢阻肺的病因时，金年会不得不提的是吸烟这一最常见和最主要的危险因素。长期吸烟不仅直接损害呼吸道，还可能导致职业性粉尘和化学气体等其他有害物质的吸入风险增加，从而加剧慢阻肺的发生。香烟中的有害物质通过诱导气道上皮炎症反应，破坏上皮屏障，促进免疫细胞的聚集，并导致粘液分泌过多和小气道壁的重塑。

近期，复旦大学上海医学院附属中山医院肺病危重症医学科张静教授团队在国际权威期刊上Free Radical Biology and Medicine发表一篇题为“ROS induced the Rab26 promoter hypermethylation to promote cigarette smoking-induced airway epithelial inflammation of COPD through activation of MAPK signaling”的文章。他们发现，香烟暴露会导致肺组织的表观遗传改变，这种改变与慢阻肺的慢性炎症紧密相关。其中，DNA甲基化作为控制表观遗传转录的主要方式，在吸烟影响下的变化尤为关键。吸烟通过调节DNA甲基转移酶的表达，进而影响到慢阻肺的发病过程。

此外，研究还揭示了香烟暴露下气道炎症反应的更深层次机制。香烟产生的活性氧（ROS）在这一过程中扮演着重要角色。ROS不仅调节DNMTs的表达，还影响到p53和Bcl2的功能，最终导致气道上皮细胞的凋亡。尽管ROS在调控基因甲基化/去甲基化过程中的具体机制尚不完全清楚，但这一发现无疑为金年会理解慢阻肺的发病机制提供了新的视角。

值得一提的是，Rab蛋白作为调节细胞功能的重要分子，在肺部炎症中也发挥着不可忽视的作用。特别是Rab26，它被发现能够抑制炎症信号，减弱肺内皮细胞的炎症反应。然而，在香烟暴露后，Rab26的作用机制及其与气道炎症的关系仍待进一步揭示。

这项研究不仅深化了金年会对慢阻肺发病机制的理解，也为未来的治疗提供了新的思路。通过深入研究ROS和Rab26等分子在气道炎症反应中的作用，金年会有望开发出更为有效的预防和治疗策略，为慢阻肺患者带来福音。

文中提到，在卷烟暴露条件下，ROS通过促进DNMT3b介导的Rab26启动子DNA甲基化来抑制Rab26的表达，下调Rab26的表达可增强p38和JNK MAPK信号的激活，导致炎症细胞因子的过量产生；NAC（N-乙酰半胱胺酸）恢复Rab26也可减轻香烟暴露诱导的气道上皮炎症反应

研究者首先建立了香烟暴露小鼠模型，使用全身香烟烟雾暴露系统，将小鼠（n = 5）暴露于20支香烟中，每天两次，每周6天，持续2小时，持续三个月。对照组（n = 5）保持在相同的环境中，包括相同的食物量，不接触香烟。全身香烟烟雾暴露系统由上海金年会仪器提供，配备全自动香烟烟雾发生器、暴露箱体和层流生物安全柜。为避免操研究者接触二手烟，暴露箱体设置在层流生物安全柜内，香烟由自动香烟烟雾发生器产生，并被泵入暴露箱。随后采集小鼠肺和支气管肺泡灌洗液（BALF）进行H&E染色、免疫组化（IHC）和炎症介质测定。同时测定小鼠的体重、白细胞计数、Hct和HbCO水平。

香烟暴露诱导气道上皮炎症反应

香烟暴露染毒的气道炎症反应是COPD的一个主要特征。在此，研究者评估了体内和体外香烟暴露气道上皮的炎症反应。H&E染色显示，香烟暴露小鼠气道上皮结构被破坏，支气管周围出现大量中性粒细胞（图.1A）。此外，肺泡空间扩大和破坏（图.1A）。病理改变与吸烟相关的COPD和肺气肿一致。全身香烟暴露小鼠的全身性炎症水平也被评估。与对照组相比，全身暴露小鼠的BALF IL-8和IL-6水平显著升高（图.1B＆C）。

图1.香烟暴露诱导体内和体外炎症反应

香烟暴露抑制了Rab26在气道上皮中的表达

数据显示，在COPD患者的样本中，肺组织中Rab26水平的PKM明显低于非COPD患者（图.2A）.IHC数据显示，香烟暴露的小鼠的肺气道上皮细胞中Rab26的表达低于对照组小鼠（图.2B）.此外，与对照组相比，香烟暴露的小鼠肺组织中Rab26的表达降低（图.2C）。

图2.香烟暴露抑制了Rab26在体内和体外的表达

DNMT3b调控Rab26的表达

DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase， DNMT）家族成员在介导基因DNA甲基化中起关键作用。因此，研究者探索了DNTM3B在香烟暴露诱导的Rab26启动子DNA甲基化中的作用。研究者发现DNMT3B在香烟暴露小鼠肺组织中的表达增加（图.3A）。免疫组化分析还显示，与对照组相比，香烟暴露组气道上皮DNMT3B水平升高（图.3B）。

图3.Rab26抑制香烟暴露诱导的起到上皮细胞炎症反应

ROS通过调控DNMT3b抑制Rab26的表达

为了确认ROS对Rab26表达的影响及其通过启动子甲基化的潜在机制，研究者将细胞用不同剂量的H₂O₂（一种ROS）处理2小时。数据显示H₂O₂增加DNMT3B蛋白的产生，抑制Rab26的表达（图.4E）。与上述结果一样，NAC预孵育细胞后，H₂O₂存在下Rab26的下调表达得到部分恢复（图.4F）。荧光素酶检测显示H₂O₂抑制Rab26启动子的活性（图.4G）。这些数据表明，香烟暴露诱导的ROS抑制了Rab26启动子的活性，下调了Rab26的表达，导致炎症介质的产生。而NAC能部分逆转香烟暴露对Rab26表达的抑制作用。

图4.ROS通过调控DNMT3b抑制Rab26的表达

抗氧化剂增强Rab26表达，减轻COPD小鼠的炎症反应

体外实验显示，香烟暴露诱导的氧化剂导致上皮细胞中Rab26的生成减少，炎症增加，而NAC（N-乙酰半胱胺酸）是目前广泛应用于治疗COPD患者。本研究通过NAC证实抗氧化剂对体内Rab26表达的调节作用，以及提高肺组织中Rab26表达对COPD小鼠炎症反应的影响。H&E显示NAC改善了鳃周区域的炎症细胞浸润（图.5A）。图7B显示，小鼠在香烟暴露期饮用NAC溶液后，Rab26表达升高，DNMT3b水平下降。同样，与香烟暴露组相比，NAC/香烟暴露组肺气道上皮中Rab26表达升高，DNMT3b表达降低（图.5C）。此外，NAC处理抑制香烟暴露诱导的IL-8和IL-6的BALF水平（图.5D＆E）。这些数据表明，ROS可能通过促进DNMT3b介导的DNA甲基化和改善香烟暴露诱导的COPD小鼠炎症反应中Rab26的表达来抑制Rab26。

图5.抗氧化剂增强了Rab26表达，减轻COPD小鼠的炎症反应

在构建慢性阻塞性肺疾病（COPD）的动物模型时，金年会仪器精心选择了一些关键的造模参数，以确保模型的准确性和可靠性。

首先，考虑到香烟暴露作为COPD发病的主要因素，因此需设定精确的香烟暴露条件。通过控制香烟烟雾的浓度、暴露频率和持续时间，可以成功模拟出长期吸烟对肺组织的损害作用。

其次，为了模拟COPD患者肺部炎症的复杂环境，引入了多种炎症介质和细胞因子的刺激。这些介质和因子的种类、浓度和作用时间均经过精心调整，以最大程度地模拟COPD患者体内的炎症反应。

此外，还需注重模拟COPD患者肺部气流受限的特征。通过调整气道阻力、肺顺应性和通气功能等参数，可以成功构建具有气流阻塞特征的COPD模型。

在整个造模过程中，严格遵循科学原则，确保实验数据的准确性和可重复性。同时，研究者还需注重动物福利和伦理原则，确保实验过程对动物的伤害最小化。

通过这些精心设计的造模参数，可以成功构建能够真实反映COPD病理生理改变的动物模型，为后续的研究提供了有力的工具：

1、仅用香烟暴露进行小鼠造模：待小鼠适应实验环境后，被随机分配到四个组：对照组、PM2.5组、吸烟组和PM2.5+吸烟组，每组有7只小鼠。对照组小鼠仅暴露在室内空气，无PM2.5。PM2.5组小鼠通过超声波雾化器吸入PM2.5（浓度为110 μg/m³）。吸烟组小鼠在香烟暴露染毒箱内吸入香烟烟雾（在2.5小时内消耗10支香烟）。PM2.5+吸烟组小鼠同时暴露于PM2.5和香烟烟雾中。暴露方式：所有小鼠每周5天，每天两次接受上述处理，持续10个月。实验结束后，小鼠被处死，并收集肺组织进行分析。

2、香烟暴露联合气道内滴注脂多糖方法进行造模：持续时间8周，除空白组外，其余各组小鼠置于自动小动物熏烟箱中，将香烟插入自动点烟盒，点燃后打开微型真空泵，将烟雾引入暴露箱体中。每天进行香烟暴露两次，间隔3小时，每次点烟8支，烟雾最大浓度状态维持30min。（备注：每次30min熏烟过程中可间隔15min适当通入少量氧气，警惕小鼠缺氧死亡）熏6天停1天，连续熏烟8周。在第1、14、21天用10%水合氯醛0.3ml/100g对各组小鼠进行腹腔麻醉，后切开颈部皮肤，暴露气管，空白组予0.2ml生理盐水气道内注射，其余各组予浓度为1mg/ml的脂多糖0.2ml气管注射（注射当日不熏烟）。

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COPD造模过程中，往往需要模拟肺部疾病的病理生理过程，特别是肺部炎症和气流受限的特征。通过使用上海金年会仪器肺部雾化给药装置，研究人员可以精确地模拟药物在肺部的作用过程，观察药物对肺部炎症和气流受限的影响，从而更准确地评估药物的疗效和安全性。

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